下面是小编为大家整理的PCB技术简介(要素、历史、影响因素、应用以及污染和预防)（完整）,供大家参考。
PCB 技术简介( 要素、历史、影响因素、应用以及污染和预防)
PCR 的历史
PCR 的进展能够说是从 DNA 合成酵素的发觉缘起。DNA 合成酵素最早于 1955 年发觉 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的 Klenow fragment of
E. Coli 那么是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所发觉, 但由于那个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 (简称 Taq polymerase), 那么是于1976 年从热泉 Hot spring 中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个专门理想的酵素，但它被广泛运用那么于 80 年代之后。PCR 的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication)，它是于 1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表第一个单纯且短暂性基因复制 (类似 PCR 前两个周期反应) 的实验。
而现今所进展出来的 PCR 那么于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 进展出的，Dr. Mullis 当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin- Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在 PCR 的相关仪器及原料上占有专门大的巿场。Dr.Mullis 并于 1985 年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量能够说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年 ， Science 将 PCR 中 的 DNA 合 成 酵 素 命 名 为 当 年 的 风 云 分子 (Molecule of the year)，而 PCR 本身那么列为年度的重要科学发明产物。因此，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。
阻碍 PCR 的因素
PCR 是专门直截了当、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与 PCR 产生的资深研究员 Henry Erlich 所言〞在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便能够无照营业〞 (PCR allows people to practice molecular biology without a liscence)。也因此，活用及慎用 PCR 是确保一定品质的必要条件。PCR 本身尽管是一个单纯的实验技术，然而一个好的PCR 反应及其产物那么是受到专门多因素的阻碍。这些因素色括反应中各种原料的浓度 (Taq. Polymerase, primers, dNTPs, MgCl2…)，也包括整个反应中各步骤的温度与时刻的设定。因此 DNA 模板(Template) 与 引信 (Primers) 本身条件也占有一定的重要性。近来的 观 念 中 ， 共 溶 剂 诸 如
Dimethyl sulfoxide (DSMO) 、 glycerol 、 Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也对整个反应产生假设干重要的阻碍。
PCR 的运用
PCR 除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR 本身可直截了当用来鉴 定 特 定 基 因 的 存 在 与 否 ， 也 能 够 用 来 侦 测 基 因 是 否 有 专门 (Gene mutation, deletion, and rearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估； 对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 (DNA sequencing) 及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。
也能够做DNA 指纹 (Fingerprints) 比对关心亲子关系的鉴定。PCR 更能够用于器官移植组织兼容性
HLA 的分析。另外在演化上的分析，经由 PCR 的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，专门是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质 (Interleukines) 及各种生长因子 (Growth factors) 基因的表现都可用 PCR 来进行质与量的分析。
PCR 污染及解决计策 PCR 检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。
一． 污染的预防
进行 PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能显现的 PCR污染或杜绝污染的显现。
〔一〕划分操作区：目前，一般 PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但不管是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR 扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
〔二〕分装试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA：
1． PCR 用水应为高压的双蒸水；
2． 引物和 dNTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制；
3． 引物和 dNTP 应分装储存，分装时应标明时刻，以备发生污染时查找缘故。
(三) 实验操作本卷须知
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的缘故，样品间的交叉污染也是缘故之一。因此，不仅要在进行扩增反应是慎重认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1. 戴一次性手套，假设不小心溅上反应液，赶忙更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时刻暴露于空气中，幸免气溶胶的污染；
3. 幸免反应液飞溅，打开反应管时为幸免此种情形，开盖前稍离心收集液体于管底。假设不小心溅到手套或桌面上，应赶忙更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，如此即能够减少操作，幸免污染，又能够增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对比和空白对比，即可验证 PCR 反应的可靠性，又能够协助判定扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种专门的加样器，至少 PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，专门是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
二． 追踪污染源
假如不慎发生污染情形，应从下面几条动身，逐一分析，排除污染。
〔一〕设立阴阳性对比：有利于监测反应体系各成分的污染情形。选择阳性对比时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对比可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。假如以含靶序列的重组质粒为对比，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对比的选择亦要慎重，因为 PCR 敏锐性极高，能够从其它方法〔Sourthern 印迹或点杂交等〕检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括 PCR体系中各试剂的时机对比，即包括 PCR 反应所需的全部成分，而不加模板 DNA，这对监测试剂中 PCR 产物残留污染是专门有益的。假如扩增结果中试剂对比为阳性结果，确实是某一种或数种试剂被污染了。现在，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应赶忙处理。
〔二〕环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，假设不久又发觉试剂被污染了，假如预防措施比较严密，那么考虑可能为环境污染。
环境污染中常见的污染源要紧有：
1. 模板提取时真空抽干装置；
2. 凝胶电泳加样器；
3. 电泳装置；
4. 紫外分析仪；
5. 切胶用刀或手术刀片；
6. 离心机；
7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；
现在可用擦拭实验来查找可疑污染源。1〕用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2〕0.1ml 去离子水浸泡；3〕取 5ml 做 PCR 实验；4〕电泳检测结果。
8. 气溶胶。假如通过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，那么污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，现在就应该更换实验场所，假设条件不承诺，那么重新设计新的引物〔与原引物无相关性〕。
三．污染处理
〔一〕环境污染
1. 稀酸处理法：对可疑器具用 1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余 DNA 脱嘌呤；
2. 紫外照耀〔UV〕法：紫外波长〔nm〕一样选择 254/300nm，照耀 30min 即可。需要注意的是，选择 UV 作为排除残留 PCR 产物污染时，要考虑 PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照耀仅对 500bp 以上长片段有效，对短片段成效不大。UV 照耀时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是 DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且 UV 照耀还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于 UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照耀的长 DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于 0.065/碱基，其他非二聚体的光照损害〔如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和 DNA 断裂等〕均可终止 Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。假如这些位点〔0.13/碱基〕在 DNA 分子上随机分布，一个 500bp片段的 DNA 分子链上将有 32 处损害位点，那么，105 个如此的分子中每个分子中会至少有一处损害。相反，假如 100bp 的片段，每条链上仅有 6 处损害，105 个拷贝分子中将有许多分子没有任何损害。这确实是 UV 照耀有一定的片段长度限制的缘故。
〔二〕反应液污染
可采纳以下方法之一处理：
1. DNase I 法：PCR 混合液〔未加模板和 Taq 聚合酶〕加入 0.5U DNase I，室温反应 30 min后加热灭活，然后加入模板和 Taq 聚合酶进行正常 PCR 扩增。该方法的优点是不需要明白
污染 DNA 的序列；
2. 内切酶法：选择识别 4 个碱基的内切酶〔如 Msp I 和 Taq I 等〕，可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用 1h 后加热灭活进行 PCR；
3. 紫外照耀法：未加模板和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液进行紫外照耀，本卷须知与方法同上述 UV 照耀法；
4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏 0.1ng 基因组 DNA，2.0 kGy 可破坏 104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不阻碍 PCR，但高于此限度会使 PCR 扩增效率下降。引物可受照耀而不阻碍 PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏 DNA 的。
〔三〕尿嘧啶糖苷酶〔UNG〕法
由于 UV 照耀的去污染作用对 500bp 以下的片段成效不行，而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右，因此 UNG 的预防作用日益受到重视和确信。
1. 原理：在 PCR 产物或引物中用 dU 代替 dT。这种 dU 化的 PCR 产物与 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N-糖基键，可除去 dU 而阻止 TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含 dU 的模板无任何阻碍。UNG 可从单或双链 DNA 中排除尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子那么无任何作用。
2. dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP，使产物中掺入大量 dU。在再次进行 PCR 扩增前，用UNG 处理 PCR 混合液即可排除 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在 PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此可不能阻碍含 dU 的新的 PCR 产物。
3. dU 引物法：合成引物时以 dU 代 dT，如此 PCR 产物中仅 5ˊ端带 dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段〔1-2kb 以上〕的扩增用 dUTP 法效率较用 dTTP低，而用 dU 法就可克服这一缺点。
dU 引物最好将 dU 设计在 3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：能够去除任何来源的污染；UNG 处理能够和 PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量 dU 存在，可完全排除污染源。
5. 需注意的是掺入 dUTP 的 DNA 不应对产物的任何操作有阻碍，在进行 PCR 产物克隆时，应该转化 UNG-〔UNG 缺陷〕大肠杆菌受体菌，否那么转化产物会被受体菌 UNG 消化掉。
〔四〕 固相捕捉法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1〕用一生物素标记的单链 RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2〕用包被链霉亲和素的固相载体来捕捉带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3〕洗脱靶分子后用特异引物扩增非 RNA 探针杂交区域。第 2〕步的漂洗后可用 PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
〔五〕RS-PCR 法〔RNA-specific PCR〕
也称为链特异性 PCR，要紧指用于 RNA 模板的特异性 PCR 法，该法可明显降低假阳性而不阻碍 PCR 的敏锐性。其关键在于设计引物，逆转录引物的 3ˊ端〔A 区〕有 2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端 2 0 个核苷酸〔C 区〕为附加修饰碱基。与 mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA 与余外引物分开，再用和第二引物〔C〕以第一链 cDNA 为模板合成第二链 cDNA，以后的 PCR 循环中用逆转录引物的 B 区和引物 C 进行扩增加尾cDNA，而污染的 DNA 或质粒 DNA 才可不能被扩增。
〔六〕抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒 DNA 克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。假如重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使显现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒 DNA 才能被引物扩
增，因此只要显现预期大小的扩增带就能够证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
四．其它 PCR 检测方法：
〔一〕 两步法：是指在用套式 PCR 方法扩增某些含量低微的标本时，两对引物在同一个管中以简化步骤，减少污染。通常第一步进行 20-25 个循环，扩增外引物片段；第二步再进行 10 个循环，扩增内引物片段。两步法对内外引物的 Tm 值有专门要求，即内外引物的退火温度高〔...
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